Cromatografía - Técnica de Separación

1.- INTRODUCCIÓN

En esta práctica de laboratorio se pretende comprender la importancia que tienen los métodos de separación de mezclas y conocer las diferentes maneras que existen de poder llevar a cabo una separación.

En esta sesión de laboratorio realizaremos la cromatografía de adsorción de una mezcla de azul de metileno y anaranjado de metilo. Además procederemos a identificar una mezcla de aminoácidos mediante una cromatografía de capa fina.

2.- FUNDAMENTO TEÓRICO

La primera parte de la práctica consistía en la separación de una mezcla líquida formada por dos compuestos fuertemente coloreados: el anaranjado de metilo y el azul de metileno. Para conseguir separarlos se empleará la cromatografía de adsorción en columna.

En toda cromatografía hay un contacto entre dos fases: una fija (conocida como estacionaria) y otra móvil, que es la que fluye durante el análisis. En nuestro caso la fase estacionaria será la alúmina y la móvil la mezcla.

Los compuestos eluídos (aquellos que se encuentran disueltos en la fase móvil) acaban saliendo por la columna. El adsorbente retiene poco aquellos disolventes cuya polaridad resulta ser baja, y debemos emplear también eluyentes de baja polaridad para extraerlos.

Después tendremos que eluir los disolventes más polares para lo cual emplearemos eluyentes de polaridad mayor.

Los absorbentes que vayamos a emplear nos pueden ser solubles en el disolvente ni reaccionar con él.

El azul de metileno (C₁₆H₁₈N₃ClS) es un compuesto aromático heterocíclico con muchos usos en diversos campos, como la biología y la química. A temperatura ambiente es un sólido sin olor de color verde oscuro, que cambia a azul cuando se disuelve en agua. En química se usa como indicador redox, ya que se vuelve incoloro al exponerse con un agente reductor.

El anaranjado de metilo (C₁₄H₁₄N₃NaO₃S) es una sal sódica del ácido sulfónico, empleada como indicador químico, ya que cambia de color a pH entre 3.1 y 4.4, pasando de rojo a naranja. También se emplea como colorante en la industria.

En la segunda parte de la práctica, vamos a tratar otro tipo de cromatografía, llamada cromatografía en capa fina. Ésta va a consistir en separar la fase estacionaria, es decir, el absorbente, de la fase móvil.

Vamos a colocar la mezcla que queremos analizar, mediante un capilar, a una distancia del borde inferior de la placa y vamos a introducirla en una cubeta donde se encontrará con la fase móvil, es decir, con el eluyente.

El eluyente va a ir ascendiendo por la cromatoplaca por capilaridad, desplazando los componentes de la mezcla a diferentes velocidades.

Cuando el disolvente se encuentre cerca del borde de la placa, se saca y se deja secar y se revela para poder ver las manchas producidas. El revelador tiene que reaccionar con los productos absorbidos.

La relación entre las distancias recorridas por un compuesto y por el disolvente viene dada por la siguiente expresión:

Factor de retardo:

La distancia recorrida por el disolvente, la distancia hasta la línea que alcanza en la parte superior de la cromatoplaca.

3.- DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

3.1.- Cromatografía de adsorción en columna

Procedemos a montar la columna en el soporte, ayudados por una pinza, de manera que quede en vertical, y le colocamos un vaso de precipitados bajo la llave de paso por si se escapase alguna sustancia. Observamos que justo encima de la llave hay una frita de vidrio.

Mezclamos 18 g de alúmina con algo más de 25 mL de etanol para introducirlo en la columna. La alúmina será la fase estacionaria. Esperamos unos minutos hasta que se asiente y abrimos la llave de paso para permitir salir parte del etanol, dejando únicamente un dedo por encima de la alúmina. Al dejarlo salir también salió algo de la frita.

A continuación introducimos la lana de vidrio, con precaución ya que aunque parezca algodón, pincha. La finalidad de esto es evitar que la alúmina reaccione con el eluyente.

Ahora introducimos 2 mL de la mezcla y abrimos la llave. Cada vez que el nivel de etanol descienda, debemos añadir más, ya que en ningún momento puede quedar seca la lana de vidrio. Comenzamos a observar que el azul comienza a filtrarse a través de la alúmina hasta que consigue llegar a la parte inferior y empezamos a recoger en el matraz una disolución azulada.

Seguimos añadiendo etanol hasta que la disolución que cae vuelve a ser incolora. En ese momento ya no queda azul de metileno en la columna y debemos comenzar a extraer el anaranjado de metilo.

Cambiamos el erlenmeyer y ahora empezamos a introducir agua por la columna, ya que necesitamos un eluyente más polar. Al igual que antes con el azul, ahora poco a poco observamos al naranja descender a través de la alúmina.

Finalmente, recogemos el naranja de metilo en el erlenmeyer hasta que ya no queda nada en la columna y la disolución que extraemos es incolora.

A continuación realizamos los espectros UV de ambas muestras para comprobar si la separación ha sido buena.

3.2.- Cromatografía en Capa Fina

Esta parte va a consistir en separar los aminoácidos alanina, fenilalanina y valina, haciendo un cromatograma de la mezcla problema y comparándola a los de los aminoácidos anteriores.

Esto lo vamos a realizar con dos eluyentes (A y B) determinando posteriormente los R_f de los aminoácidos en cada eluyente.

Para llevar a cabo la separación de la mezcla, cogemos dos cromatoplacas y hacemos una línea con un lápiz a un centímetro del extremo inferior de las placas, sobre la cual vamos a colocar, mediante un capilar, una gota de cada disolución de aminoácidos y de la disolución problema. Haciendo lo mismo en las dos placas.

Una vez que tenemos esto, introducimos una placa en posición vertical en un bote con eluyente A y la otra en la misma posición, en un bote con eluyente B. Las placas tienen que estar sumergidas un centímetro en el eluyente.

Se deja actuar al eluyente por capilaridad hasta que se encuentre a un centímetro de la parte superior de la placa. Una vez que esto suceda, sacamos las placas y las dejamos secar al aire marcando con lápiz la línea hasta donde ha llegado el eluyente.

Una vez que se han secado, las metemos en una estufa hasta que se observe la aparición de manchas coloreadas.

Cuando dispongamos de ambas placas con las manchas, calcularemos los valores de R_f para cada mancha, tanto de las disoluciones conocidas como de la muestra. Con estos datos obtenemos cual es la muestra problema.

4.- RESULTADOS EXPERIMENTALES

4.1.- Cromatografía de adsorción en columna

Tras conseguir separar el azul de metileno y el anaranjado de metilo en dos matraces distinto, procedemos a analizar una muestra de ambos en el espectro UV para determinar si la separación ha sido buena o no, obteniendo los siguientes resultados:

Como puede verse, los máximos de ambas muestras no coinciden, lo que quiere decir que la separación de ambas mezclas ha sido óptima, únicamente la de naranja presenta un poco de azul de metileno (635.68 nm) pero es tan poco que se puede despreciar.

4.2.- Cromatografía en Capa Fina

Una vez obtenidas las dos placas con las manchas coloreadas, directamente observamos que la mezcla problema es una mezcla de dos aminoácidos puros que hemos tomado.

Observamos que los puntos de los aminoácidos que son iguales coinciden, es decir, que han recorrido la misma distancia.

En la foto se observa la línea en la que se colocaron las gotas de los diferentes aminoácidos (línea amarilla), la línea a la que llega el eluyente (línea azul), los puntos que aparecieron que corresponden a los siguientes aminoácidos, de izquierda a derecha: alanina, fenilalanina, valina y muestra, la cual se observa que tiene dos puntos a los que denominaremos muestra1 (el de más abajo) y muestra2 (el de más arriba).

Aun así, para cerciorarnos de estos resultados, calculamos los Rf de cada aminoácido y de la muestra en ambos eluyentes.

Utilizando la siguiente formula obtenemos los datos que queremos:

En el eluyente A:

•  Rf(alanina)=8/30=0,27
•  Rf(fenilalanina)=15/29=0,52
•  Rf(valina)=11/29=0,34
•  Rf(muestra1)=8/29=0,27
•  Rf(muestra2)=11/29=0,38

Por lo que podemos afirmar que la muestra1 corresponde con el aminoácido alanina y la muestra2 con el aminoácido valina, lo que corrobora lo visto en las placas.

En el eluyente B:

• Rf(alanina)=10/26=0,38
• Rf(fenilalanina)=17/27=0,63
• Rf(valina)=14/27=0,52
• Rf(muestra1)=14/29=0,48
• Rf(muestra2)=16/29=0,55

Con este segundo eluyente, se observa también de forma muy clara como la muestra2 coincide con la valina. En este caso, la muestra1 esta un poco mas dudosa, ya que teóricamente se debería corresponder con la alanina, pero experimentalmente vemos que sus valores difieren. Esto puede ser debido a que el eluyente no ha subido homogéneamente.

Lo que podemos afirmar es que con el disolvente B, los compuestos han adquirido una velocidad mayor.

Tras la cromatografía en capa fina, obtenemos que la muestra a estudiar es una mezcla de dos aminoácidos: alanina y valina.

5.- CUESTIONES

1.- Enumere alguna de las razones que condicionan la elección de un adsorbente y de un eluyente para realizar una separación cromatográfica concreta.

Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta: el tamaño de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente (yeso,...); que sea insoluble en el disolvente que se va utilizar, no debe reaccionar con las sustancias que se van a separar ni catalizar procesos de descomposición.

La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo.

En la elección del eluyente influyen varios factores, como son el precio y la pureza.

Además de esto, hay que tener en cuenta que no se pueden utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad), ni compuestos muy volátiles y evitar que contengan trazas de metales (catalizadores). La elección del eluyente se realiza de forma empírica, hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una manera.

2.- Busque las estructuras de cada uno de los colorantes separados y a partir de ellas justifique cuál es más polar.

Azul de metileno

A continuación se señalan las zonas de la molécula que presentan polaridad:

Las zonas señaladas en verde presentan polaridad elevada, al igual que la morada, aunque la zona más polar es la señalada en rojo.

Anaranjado de metilo

En esta molécula la zona verde representa la misma situación que en la de arriba. La zona representada en círculo morado presentaría polaridad, pero los momentos dipolares se anulan por ser simétricos e ir en sentidos contrarios. La zona roja, en cambio, es polar.

Tras el análisis, podemos concluir que el anaranjado de metilo es una molécula más polar que el azul de metileno.

3.- A partir de la tabla que se acompaña, razone las posibilidades de separación por cromatografía de capa fina de las mezclas de aminoácidos siguientes, indicando el disolvente utilizado.

	Valor aproximado de Rf Disolvente 1	Valor aproximado de Rf Disolvente 2
Arginina	0.15	0.15
Cistina	0.12	0.22
Lisina	0.10	0.20
Asparagina	0,20	0,43
Ácido glutámico	0,33	0,40
Alanina	0,29	0,50
Leucina	0,57	0,69
Metionina	0,47	0,63
Tirosina	0,52	0,69

Caso 1

Incremento de distancias:

	Disolvente 1	Disolvente 2
Arginina-Cistina	0,03	0,07
Arginina-Lisina	0,05	0,05
Cistina-Lisina	0,02	0,02

En este caso el disolvente utilizado sería el disolvente 2 ya que los incrementos son mayores.

Caso 2

Incremento de distancias:

	Disolvente 1	Disolvente 2
Asparagina-Ác.glutámico	0,13	0,03
Asparagina-Alanina	0,09	0,07
Ác.glutámico-Alanina	0,04	0,10

En este caso el disolvente utilizado sería el disolvente 1 ya que los incrementos son mayores.

Caso 3

Incremento de distancias:

	Disolvente 1	Disolvente 2
Leucina-Metionina	0,10	0,06
Leucina-Tirosina	0,05	0,00
Metionina-Tirosina	0,06	0,06

En este caso el disolvente utilizado sería el disolvente 1 ya que los incrementos son mayores.

6.- BIBLIOGRAFíA

http://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_orange

http://en.wikipedia.org/wiki/Methylene_blue

http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_en_capa_fina

http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina